贴壁细胞and悬浮细胞构建稳株tips

现在我基本不会因为慢病毒感染发愁了，已基本摸清楚细胞的尿性。 这篇笔记说的是感染完病毒完后面的流程了，前面的流程：包装病毒protocol，包装病毒和感染细胞的tips之前发过，大家自行翻看。 ✅嘌呤霉素浓度的确定： 可以去查文献，如果文献查不到，那就使用这种方法，贴壁细胞和悬浮细胞一样的步骤是：摸puro浓度的过程，用药设置浓度梯度处理细胞，处理1天或两天分别观察细胞状态和死亡情况，选择细胞死亡率在百分之50的那个临界浓度上下浮动确定用药浓度，一般悬浮细胞比较敏感用药浓度比较低，几百ng，贴壁细胞用药浓度高，可以达到ug级别。 ✅筛选阳性细胞and构建稳株的前提： 病毒感染阳性率至少大于百分之30，阳性率太低不行，容易失败。（关于如何提高病毒感染效率看合集～细胞实验～里的笔记） ✅如何筛选阳性细胞 确定好浓度以后，加对应浓度的药物进入已感染的细胞里。 💅重点来了～悬浮细胞筛一天，停一天，停一天以后继续筛，再停，这样筛2～3次，具体几次看情况，根据细胞状态自己感受。 贴壁细胞筛两天，停一天，再继续筛，如果特别敏感的贴壁细胞用和悬浮一样的方法。 停药方法：筛一天以后离心，离心转速：400rpm*5min，悬浮细胞离一次，贴壁细胞离两次，离完以后PBS洗一遍，然后放到新的培养基里，就算停止puro筛选。 小贴士： 1.悬浮细胞洗一遍就行，贴壁起码洗2～3遍，贴壁细胞阴性细胞和阳性细胞容易粘住，多洗两遍。 2.去掉死细胞也就是阴性细胞，只保留阳性细胞，这个筛选的过程，离心速度一定不要高！！！400～500rpm即可，不然筛不掉的。